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荧光显微系统质量评估应用分享第4期:“二维点阵”图案用于场照均匀性分析

2022/6/10

Argolight荧光定量标准片是专门为荧光显微系统的性能评估、参数验证、校准和监控而设计的。它包含多种二维和三维的荧光图案。


本系列文章是针对Argolight荧光定量标准片中的每个荧光图案进行部分应用案例的分享。其中一些应用可以通过Argolight配套的图像处理软件“Daybook”完成,有一些则可以通过人类视觉或其他辅助软件进行分析。具体请联系西诺光学,见文末联系方式。


以下内容将为大家详细介绍Argolight荧光定量标准片中“二维点阵”图案及其用于场照均匀性分析的案例。


矩形“二维点阵”图案


1:例如Argo-SIM v2.0中的“二维点阵”图案。由21×21个小圆环组成的矩阵。每个圆环间5μm间隔,总面积为100μm×100μm。矩阵由八个定位标包围,中心有一个3μm长的十字。


“二维点阵”在不同通道上进行成像,然后对比分析可以得到系统的以下性能的验证

l 照明的均匀性(本文详细介绍)

l 视野内的畸变(下期内容)

l 不同通道下的横向色移

l 线扩散函数


如下图展示了使用共聚焦显微镜在不同通道配置下获取的“二维点阵”图像:

l 物镜:40×/1.3平面复消色差油物镜

l 通道:分别在四种通道下成像


2:Argo HM;使用40×/1.3平面复消色差油物镜,对(a)DAPI、(b)GFP、(c)Texas Red和(d)Cy5通道进行共聚焦显微镜成像。图像经过放大。


场照均匀性


问题 在任何荧光显微镜中,照明强度的空间分布从来都不是恒定的。它通常在视野中心最大(如果显微镜对齐良好),并向边缘减小,因此生物样品不会被均匀照明。


共聚焦显微镜的衰减值(Roll-off value)*应低于20-30%,具体取决于制造商和所使用的系统。因此,了解样本上照明强度的空间分布对于防止误判生物样本图像中的强度差异非常重要。


*衰减值(Roll-off value):均匀荧光样品图像中最大和最小归一化强度值之间的差值。


有关信息和文献中可以找到描述场照均匀性的不同英文名称:uniformity, evenness, flatness of illumination, shading.


实例 从图2所示的“二维点阵”图像中,Daybook(Argolight荧光定量标准片配套的分析软件)可以提取有关照明均匀性的信息。


3显示了通过Daybook分析得到的归一化均匀性热图(heatmap)。这些热图可以确定照明的空间分布,从中可以提取不同的强度剖面(参见图4)和许多参数(参见表1)。


1显示,对于所有通道,沿紫色对角线的衰减值小于20%,而沿粉色对角线的衰减值要高得多。


3:(a)DAPI、(b)GFP、(c)Texas Red和(d)Cy5通道的归一化照明均匀性热图。每个热图中的两个小十字对应于绿线穿过的强度的最大值和最小值。



4:(a)DAPI、(b)GFP、(c)Texas Red和(d)Cy5通道的非归一化和归一化强度剖面,分别沿着通过最大和最小强度的线(绿线)以及沿着热图的对角线(紫色和粉色虚线)。



1:与DAPI、GFP、Texas Red和Cy5通道的照明均匀性相关的一些相关参数。有关这些参数的含义和计算的更多信息,请咨询我们。


以上是本期关于场照均匀性的分享,下周第5期将为大家继续分享“二维点阵”图案的场畸变和线扩散函数的案例。请大家持续关注“sinoptix”微信公众号。


  具体请咨询:西诺光学

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